共軛焦顯微鏡簡介
 
雷射掃描共軛焦顯微鏡
 

 

共軛焦顯微技術主要是利用針孔光圈（pinhole）將非聚焦面（on-focal plane）的光排除在外，而形成了共軛焦影像。因為在傳統的螢光顯微鏡下觀察影像時，不僅有來自聚焦面的光，非聚焦面的光也影響了影像的解析度；共軛焦顯微鏡的技術可去除傳統螢光顯微鏡影像中的迷光，可將樣品一層一層觀察，增加了影像的對比和解析度。
  
 
                                          
                                          圖：共軛焦顯微鏡原理
 
 
 
 
 
 配合全自動螢光顯微鏡和Leica LAS AF 操作軟體，共軛焦顯微鏡可進行多維影像（multi-dimentional）的觀察和影像處理。多維影像包括在同一樣品上觀察多種不同顏色的螢光強度，可同時偵測多種目標；z軸斷層掃描，依樣品的厚度指定欲掃描的上、下位置和光學切片的厚度，取得一系列不同z position的影像；時間序列掃描，觀察樣品的亮度或位置隨時間不同的變化情形；之後可將所有影像堆疊成3D影像，也可作各種角度旋轉，並輸出為連續影片播放。
 
一般功能與用途：
  1.   共軛焦顯微影像之擷取與觀察。
  2.   多維影像之觀察：xy，xz，xt，xyz，xyt，xyzt……。
  3.   螢光樣本影像擷取觀察（共軛焦模式）。
  4.   3D影像結構重組，觀察各部分之細微結構。
  5.   細胞間反應或蛋白質折疊效果觀察與分析：：FRET。
  6.   細胞膜動力學之觀察研究：：FRAP。
  7.   Photoactive，Cage，Uncage之應用。
  8.   含活細胞培養裝置，供恆溫與CO2/O2/N2濃度調控。
 
    核心設施目前有四套共軛焦顯微系統，【Leica TCS SP5】、【Leica TCS SP5 II】、【Nikon A1R】以及【Leica Stellaris 8】。其規格分述如下：
 
一、Leica TCS SP5共軛焦顯微系統
I.掃描器本體 (Scanner Head ):
1.          共軛焦掃描器內可最多同時執行5組入射光(螢光)分光光譜掃描感測器(5 channel spectrophotometer detectors )。每一個螢光感測器（PMT）都可獨立依據各個螢光染劑的感測光譜自行設定擷取範圍而無任何傳統濾鏡限制( filterless design )，連續感測光譜可調範圍為400 – 800 nm。本次規格掃描器內含3組感測器(PMT)及1組穿透光感測器，除同時掃描外亦可進行排序掃描( sequential scanning )。
2.          使用單一稜鏡分光光譜模式偵測，非傳統Grating分光模式。每組螢光偵測器均使用可調控光柵控制螢光接收範圍，亦可以數值輸入設定，最小解析達1 nm。
3.          螢光感測器(PMT )採用水冷式cooling設計，可有效降低雜訊，提高訊噪比（S/N ratio）。
4.          掃描器可切換安裝使用於正立與倒立顯微鏡，無須再作任何光路與控制調整。
5.          3組獨立的雷射光纖導光口，供紫外光雷射(或405nm)、可視光雷射與紅外光雷射同時傳導。完全以AOTF作為激發光波長選取與雷射強度控制，為UV(or 405 nm)-VIS-IR皆通用之共軛焦系統。
6.          共軛焦分光光譜掃描光路具有單一共軛焦感測孔徑(Pinhole)，微電腦控制，孔徑可調( max. 600um )。
7.          高解析傳統掃描模式規格：
 Max. line frequency : 2800 Hz
 Min. line frequency : 1 Hz
 Max. frame rate at 512 x 512: 5 f/s
 Max. frame rate 512 x 16: 50 f/s
 Scan zoom: 1 – 64x
8.          高解析傳統掃描模式之解析最高可達 8192 x 8192 x 16 bits灰階影像，數位化12 bits或8 bits per channel，掃描視野大小可達中間影像對角線21 mm以上。
9.          光學動態旋轉掃描範圍: 200度。
10.      可對任何所選用的鏡頭自動選取紫外光(或405nm)校正孔徑稜鏡( UV correction Pinhole Lens )
11.      可控制兩組縱深光切掃描載物檯 ( Galvanometer Z-stage及Microscope E-Stage或Microscope nosepiece )。
12.      具有PMT靈敏度補正設計，可依需求於Z軸掃瞄時同時補正PMT的電壓，以維持3D掃瞄時每一張影像螢光強度的穩定。
13.      Galvanometer Z-stage，縱深精確度優於3 nm，行程1500um。
14.      所有之調控參數均可由panel box調控，且panel box具有LCD顯示功能。
15.      具有Best focus與auto gain設計。
 
II. 多重雷射砌合分光系統 ( Acousto Optical Beam Splitter, AOBS ) 
1.          以專利之超音波光學調變裝置篩選激發與釋放波長,激發波長篩選精度達2 nm，無傳統分光濾鏡組。
2.          最多可同時分光八組雷射激發光源。
3.          可程式控制八組雷射激發光源之強度與分光比例。
 
III. 多重雷射系統與AOTF控制系統
    1.   雷射系統I: 65mW Ar-Blue Laser, 458nm, 476nm, 488nm, 514nmW
    2.   雷射系統II: 1mW HeNe Green laser, 543nm.
    3.   雷射系統III: 2mW HeNe Orange laser, 594nm.
    4.   雷射系統III: 10mW HeNe Red Laser , 633 nm.
    5.   AOTF光纖傳導,可同時控制8 組可見光雷射波段.
    6.   50 mW氣冷式405nm diode laser。
    7.   物鏡(10x, 20x, 40x, 63x oil)均有405nm校正孔徑聚光鏡。
 
IV.系統電腦及影像處理工作站(包括2個19" TFT LCD顯示器)
1.          系統工作站Pentium IV DUO 2,13GHz，4G MB以上DDR記憶體，2 組 19” LCD顯示器。
2.          系統電路控制器，可同時操控5組感測系統。
3.          掃描器控制設計採用 FRGA ( Field-Programmable Gate Array )。
4.          訊號出入 ( Trigger IN / OUT )可同時操控8組感測器 ( Detectors )，12 bits解析。
5.          系統軟體Windows XP Pro。
6.          標準系統軟體部分( System software)：
    Continuous Scan
    Single Image Scan ( for light sensitive experiments )
   Image Series Scan
    AOTF used to minimize specimen bleaching              
    Dye based pre-sets to control scans (Instrument Settings)
    Scan-Parameters are attached to image for later reconstruction.
    Unidirectional & phase corrected Bi-directional Scans
    13 scanning mode: t, xt, xλ, xyt, xyλ, xz, xzλ, xyz, xyzλ, xyt, xzt, xyzt, xytz
    Region of interest scan
    Excitation Multiplexing
    Frame Average
   Line Average
  7.   應用軟體部份( Application software)：
              Time-lapse Recording - Observation of dynamic processes by
               xt series
               xyt series
               xyzt series ( Time/Volumes series scan )
              Sequential Scan - Change of Instrument settings
       Volume by volume, Frame by frame, or Line by Line for Cross-Talk elimination
       3D projection and animation
       FRAP, FREP application
       Dye finder function
 
V.共軛焦專用全自動倒立螢光顯微鏡(可供紫外光雷射通過 )
1.          全自動倒立式螢光顯微鏡，內置共軛焦掃描專用光路控制器，可直接銜接共軛焦掃描器，且螢光模式與共軛焦掃描模式為電動切換，可由共軛焦軟體直接控制。
2.          無線遠光學修正系統設計與光學平衡對比修正設計- Harmonic Contrast System。
3.          採用外掛式電動控制系統，遠離電控裝置可能產生的電磁干擾。
4.          光學元件採用高穿透率石英玻璃材質( UV可通過 )。
5.          顯微鏡基座內建12V/100W鹵素燈源，目鏡一對10x，FOV=25mm。
6.          6孔電動鏡頭鼻輪，縱深精確度優於15 nm。
7.          6孔旋轉聚光鏡，工作距離28mm以上。
8.          4孔電動旋轉干涉對比(DIC)用菱鏡轉盤。
9.          6孔電動旋轉螢光濾鏡組， HBO100W汞燈光源。
10.      3組螢光濾鏡組，供UV、Blue、Green激發光使用。
11.      電動干涉對比模組 ( 4-pos. disc, polarizer, analyzer,, objective prism, condenser prism )。
 
VI.共軛焦專用高解析物鏡組
  1.   HC PL APO 10x/0.40 CS, WD=2.2mm, UV/405nm雷射適用
  2.   HC PL APO 20x/0.70, WD=0.59mm, UV/405nm雷射適用
  3.   HCX PL-APO 40x/1.25-0.75 Oil CS, WD=0.1mm, UV/405nm雷射適用
  4.   HCX PL APO 63x/1.40-0.60 Oil,CS, WD=0.1mm, UV/405nm雷射適用
 
VII.活細胞培養裝置
1.          本裝置需直接架設在共軛焦顯微鏡上使用。
2.          專用恆溫加熱載物台，可維持樣本培養溫度的恆定，可放置一般玻片或35-58mm培養皿以及slide chamber等。
3.          數位式精確溫度控制器，具雙控制感應裝置與溫度數據顯示，並設有迴路感應裝置，以達到全系統恆定狀態。
4.          二氧化碳濃度控制器，可精確維持培養器內二氧化碳的濃度，以維持細胞培養的酸鹼值恆定。二氧化碳的濃度控制範圍為0%-20%。與上述溫度控制器結合後，成為完整的活細胞酸鹼值恆定與恆溫控制系統。
5.          二氧化碳偵測器為NDIR設計。
6.          可將100%氧氣鋼瓶輸出之氧氣自動混合成不同比例之氧氣混合氣體，混合範圍0.1-20%或廣於。
 
 
 
 
 
二、Leica TCS SP5 II共軛焦顯微系統
 
I.掃描器本體 (Scanner Head ):
 
  1.   共軛焦掃描器內可最多同時執行5組入射光(螢光)分光光譜掃描感測器(5 channel spectrophotometer detectors )。每一個螢光感測器（PMT）都可獨立依據各個螢光染劑的感測光譜自行設定擷取範圍而無任何傳統濾鏡限制( filterless design )，連續感測光譜可調範圍為400 – 800 nm。本次規格掃描器內含3組感測器(PMT)及1組穿透光感測器，除同時掃描外亦可進行排序掃描( sequential scanning )。
  2.   使用單一稜鏡分光光譜模式偵測，非傳統Grating分光模式。每組螢光偵測器均使用可調控光柵控制螢光接收範圍，亦可以數值輸入設定，最小解析達1 nm。
  3.   螢光感測器(PMT )採用水冷式cooling設計，可有效降低雜訊，提高訊噪比（S/N ratio）。
  4.   掃描器可切換安裝使用於正立與倒立顯微鏡，無須再作任何光路與控制調整。
  5.   3組獨立的雷射光纖導光口，供紫外光雷射(或405nm)、可視光雷射與紅外光雷射同時傳導。完全以AOTF作為激發光波長選取與雷射強度控制，為UV(or 405 nm)-VIS-IR皆通用之共軛焦系統。
  6.   共軛焦分光光譜掃描光路具有單一共軛焦感測孔徑(Pinhole)，微電腦控制，孔徑可調( max. 600um )。
  7.   高解析傳統掃描模式規格：
            Max. line frequency : 2800 Hz
            Min. line frequency : 1 Hz
            Max. frame rate at 512 x 512: 5 f/s
            Max. frame rate 512 x 16: 50 f/s
            Scan zoom: 1 – 64x
  8.   高解析傳統掃描模式之解析最高可達 8192 x 8192 x 16 bits灰階影像，數位化12 bits或8 bits per channel，掃描視野大小可達中間影像對角線21 mm以上。
  9.   光學動態旋轉掃描範圍: 200度。
  10.  可對任何所選用的鏡頭自動選取紫外光(或405nm)校正孔徑稜鏡( UV correction Pinhole Lens )
  11.  可控制兩組縱深光切掃描載物檯 ( Galvanometer Z-stage及Microscope E-Stage或Microscope nosepiece )。
  12.  具有PMT靈敏度補正設計，可依需求於Z軸掃瞄時同時補正PMT的電壓，以維持3D掃瞄時每一張影像螢光強度的穩定。
  13.  Galvanometer Z-stage，縱深精確度優於3 nm，行程1500um。
  14.  所有之調控參數均可由panel box調控，且panel box具有LCD顯示功能。
  15.  具有Best focus與auto gain設計。
 
II. 多重雷射砌合分光系統 ( Acousto Optical Beam Splitter, AOBS ) 
    1.  以專利之超音波光學調變裝置篩選激發與釋放波長,激發波長篩選精度達2 nm，無傳統分光濾鏡組。
    2.  最多可同時分光八組雷射激發光源。
    3.  可程式控制八組雷射激發光源之強度與分光比例。
 
III. 多重雷射系統與AOTF控制系統
    1.   雷射系統I: 65mW Ar-Blue Laser, 458nm, 476nm, 488nm, 514nmW
    2.   雷射系統II: 1mW HeNe Green laser, 543nm.
    3.   雷射系統III: 2mW HeNe Orange laser, 594nm.
    4.   雷射系統III: 10mW HeNe Red Laser , 633 nm.
    5.   AOTF光纖傳導,可同時控制8 組可見光雷射波段.
    6.   50 mW氣冷式405nm diode laser。
    7.   物鏡(10x, 20x, 40x, 63x oil)均有405nm校正孔徑聚光鏡。
 
IV.系統電腦及影像處理工作站(包括2個19" TFT LCD顯示器)
    1.   系統工作站Pentium IV DUO 2,13GHz，4G MB以上DDR記憶體，2 組 19” LCD顯示器。
    2.   系統電路控制器，可同時操控5組感測系統。
    3.   掃描器控制設計採用 FRGA ( Field-Programmable Gate Array )。
    4.   訊號出入 ( Trigger IN / OUT )可同時操控8組感測器 ( Detectors )，12 bits解析。
    5.   系統軟體Windows XP Pro。
    6.   標準系統軟體部分( System software)：
               Continuous Scan
               Single Image Scan ( for light sensitive experiments )
               Image Series Scan
               AOTF used to minimize specimen bleaching
               Dye based pre-sets to control scans (Instrument Settings)
               Scan-Parameters are attached to image for later reconstruction.
               Unidirectional & phase corrected Bi-directional Scans
               13 scanning mode: t, xt, xλ, xyt, xyλ, xz, xzλ, xyz, xyzλ, xyt, xzt, xyzt, xytz Region of interest scan
               Excitation Multiplexing
               Frame Average
               Line Average
  7.  應用軟體部份( Application software)：
               Time-lapse Recording - Observation of dynamic processes by
               xt series
               xyt series
               xyzt series ( Time/Volumes series scan )
               Sequential Scan - Change of Instrument settings
               Volume by volume, Frame by frame, or Line by Line for Cross-Talk elimination
               3D projection and animation
               FRAP, FREP application
               Dye finder function
 
V.共軛焦專用全自動倒立螢光顯微鏡(可供紫外光雷射通過 )
  1.   全自動倒立式螢光顯微鏡，內置共軛焦掃描專用光路控制器，可直接銜接共軛焦掃描器，且螢光模式與共軛焦掃描模式為電動切換，可由共軛焦軟體直接控制。
  2.   無線遠光學修正系統設計與光學平衡對比修正設計- Harmonic Contrast System。
  3.   採用外掛式電動控制系統，遠離電控裝置可能產生的電磁干擾。
  4.   光學元件採用高穿透率石英玻璃材質( UV可通過 )。
  5.   顯微鏡基座內建12V/100W鹵素燈源，目鏡一對10x，FOV=25mm。
  6.   6孔電動鏡頭鼻輪，縱深精確度優於15 nm。
  7.   6孔旋轉聚光鏡，工作距離28mm以上。
  8.   4孔電動旋轉干涉對比(DIC)用菱鏡轉盤。
  9.   6孔電動旋轉螢光濾鏡組， HBO100W汞燈光源。
  10.  3組螢光濾鏡組，供UV、Blue、Green激發光使用。
  11.  電動干涉對比模組 ( 4-pos. disc, polarizer, analyzer,, objective prism, condenser prism )。
  12.  電動掃描式載物台，可由共軛焦軟體直接控制。
 
VI.共軛焦專用高解析物鏡組
  1.   HC PL APO 10x/0.40 CS, WD=2.2mm, UV/405nm雷射適用
  2.   HC PL APO 20x/0.70, WD=0.59mm, UV/405nm雷射適用
  3.   HCX PL-APO 40x/1.25-0.75 Oil CS, WD=0.1mm, UV/405nm雷射適用
  4.   HCX PL APO 63x/1.40-0.60 Oil,CS, WD=0.1mm, UV/405nm雷射適用
 
VII.活細胞培養裝置
  1.   本裝置需直接架設在共軛焦顯微鏡上使用。
  2.   專用恆溫加熱載物台，可維持樣本培養溫度的恆定，可放置一般玻片或35-58mm培養皿以及slide chamber等。
  3.   數位式精確溫度控制器，具雙控制感應裝置與溫度數據顯示，並設有迴路感應裝置，以達到全系統恆定狀態。
  4.   二氧化碳濃度控制器，可精確維持培養器內二氧化碳的濃度，以維持細胞培養的酸鹼值恆定。二氧化碳的濃度控制範圍為0%-20%。與上述溫度控制器結合後，成為完整的活細胞酸鹼值恆定與恆溫控制系統。
  5.   二氧化碳偵測器為NDIR設計。
  6.   可將100%氧氣鋼瓶輸出之氧氣自動混合成不同比例之氧氣混合氣體，混合範圍0.1-20%或廣於。
 
 

三、Nikon A1R共軛焦顯微系統

 

Ⅰ.A1R Resonant掃描器為1K：
1.          雷射掃瞄器共兩組：採用Galvano Scanner，解析度至少可達4096*4096; 採用Resonant Scanner，解析度至少可達1024*1024。
2.          Galvano Scanner掃描速度：標準模式下，512*512，雙向掃，每秒可掃2張; 512*32解析下，每秒可掃24張。高速模式下，512*512雙向掃，每秒可掃10張; 512*32則可達每秒130張。變焦Zoom須可達1000倍。
3.          Resonant Scanner掃描速度：標準模式下，1024*1024，每秒可掃15張; 512*512解析下，每秒可掃30張; 256*256，每秒可掃60張; 512*32則可達每秒420張。變焦Zoom段數：7 steps含以上最高可至8倍含以上。
4.          視野範圍：須達18mm含以上。
5.          針孔：圓形設計，收光效率最大化，可自由調整尺寸。
6.          掃描方式：X-Y, X-Z, XY旋轉, 縮放, ROI, XYZ, 時間解析, 光刺激, 多點位置掃描, 大範圍掃描拼圖。
Ⅱ.confocal控制器及Ａ1連接器組合：
   為搭配本院核心設施現有Ti-E-SIM連接所需。目前顯微鏡所配置的鏡頭如下：
CFI Plan Apochromat 10X
N.A. 0.45, W.D. 4.00 mm
CFI Plan Apochromat VC 20X
N.A. 0.75, W.D. 1.00 mm
CFI Plan Apo IR 60XWI
NA 1.27, W.D. 0.17 mm
CFI Apochromat TIRF 100XH
N.A. 1.49, W.D. 0.12 mm
CFI Plan Fluor DLL 10X
N.A. 0.3, W.D. 16.00 mm, PH1
CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20X
N.A. 0.45, W.D. 8.2~6.9 mm, PH1
Ⅲ. A1 專用雷射規格：
為LU-N4:405/488/561/640波長雷射組：
   雷射模組基座，含四支雷射：                                         
固態雷射四色模組405nm,488nm,和561nm, 640nm。
需達到內部光路已於出廠進行優化固定，永久免校正，雷射校準不會因環境變化而受到影響，前方具備隨即按鍵開關不同波段，可延長雷射使用壽命。
Ⅳ. 專業用電腦工作站：
為整合系統並提升高速掃描之效能，須搭配Core i7含以上高效能處理器及專業繪圖顯示卡; 搭載SDD及HDD。
Ⅴ. 軟體功能需求：
1.          專業影像軟體可支援JP2, JPG, TIFF, BMP, GIF, PNG, ND2, JFF, JTF, AVI,ICS/I共11種檔案格式，適用於螢光回復(FRAP)、螢光漂白(FLIP)、螢光共振能量傳遞(FRET)、光激發(Photo activation)、三維縮時影像擷取、多點定位縮時影像擷取、螢光共位(colocalization)等實驗。
2.          澄清化模組，使得擷取的影像可得到超解析（小於200nm樣品之解析力）的效果。
3.          需包含以下主功能及其他分項功能：
(1)   可寫入及讀取Zeiss LSM檔以及Nikon ND2檔。
(2)   Z軸掃描時，需提供Z Intensity Control功能，可隨樣品深度調整雷射能量及Gain值，確保影像品質。
(3)   多維度拍攝時可以依照使用者需要切換執行順序。
(4)   需能完成螢光共位分析（Co-Localization），可分析兩種螢光訊號的交互重疊範圍。
(5)   光譜訊號圖檔Unmixing分析。
(6)   即時可互動式三維圖檔積分建立，旋轉角度呈現，並可輸出影片為MP4格式。
(7)   可由滑鼠直接拖拉式控制載物台XY移動、滾輪控制Z軸焦距。
(8)   可適應明室或暗室做界面顏色的單鍵切換。
(9)   軟體內建四段可調操作界面字體大小。
(10)            內建多重使用者帳戶管理系統及操作界面客製化。
(11)            軟體可藉由巨集自動化回復初始設定，減低故障機率以及維護成本。
(12)            可分析長時間拍攝下的螢光強度變化（Time measurement）。
 
分項功能需包含以下：
A、影像擷取
1.           長時間影像紀錄：Time-Lapse實驗設定
2.           不同焦距面影像擷取：Z series影像擷取
3.           不同螢光通道影像擷取：Multi-channel影像擷取，並可設定不同通道間的焦距差異，實現多色同焦的影像。
4.           支援多維影像擷取：XYZT, XYZ multi-channel, XYT multi-channel
5.           使用者自訂視窗模式:可依據使用者不同需求，變更設定軟體介面
6.           可自動儲存路徑:在影像保持及時預覽情況下，可連續擷取影像至指定資料夾內
B、                影像處理
1.          自動白平衡校正
2.          影像明暗對比Gamma調整
3.          多通道螢光疊圖功能
4.          影像濾鏡處理
5.          影像標寫註記功能
6.          可製作XYZT四維影像及XYT三維影像
C、手動量測
1.         基本幾何形狀量測：直線、曲線、橢圓、圓、矩形、不規則形
2.         角度、半徑量測
3.         自動量測
4.         刻度尺校正及置放
5.         彩色(多色)手動計數
6.         自動/手動分組計算/計數
7.         線性色階強度量測
D、自動化分析
8.         依據使用者定義，自動量取個體個數及面積百分比
9.         軟體可判斷相連的個體，並自動將其分離以確保數據正確
10.     可利用面積或螢光強度等為標準進行第二次篩選
11.     可進行多色螢光定量分析
12.     可搭配布林邏輯進行複雜分析
E、影像管理
13.     報告書製作
14.     可存取多種類檔案格式，如ND2、LSM、JEPG、BMP、TIFF、JEPG2000、PNG、AVI
    等。

 

F、巨集：巨集 (Macros) 撰寫，編輯，儲存。

 

 

 

 

四、Leica Stellaris 8
超解析時脈頻譜白光雷射掃描共軛焦顯微鏡暨螢光生命週期影像平台
 
I.掃描器本體 (Scanner Head ):
1.          光譜式共軛焦掃描器，掃瞄器內最多可裝置5組入射光(螢光)光譜掃描感測器(5 channel spectrophotometer detectors )。每一個螢光感測器（Power Hybrid）都可獨立依據各個螢光染劑的感測光譜自行設定擷取範圍而無任何傳統濾鏡限制( filterless design )，螢光收光光譜可調範圍為410 – 850 nm，調整精度1nm。
2.          使用單一稜鏡分光光譜模式偵測，非傳統Grating分光模式。每組螢光偵測器前均使用可調電控光柵控制螢光接收範圍，亦可以數值輸入設定，最小解析達1 nm。
3.          本掃描器內含4組入射光（螢光）感測器及1組穿透光感測器，入射光感測器為三組超靈敏Power HyD S感測器及一組超靈敏光子計量感測器（Power HyD X，FLIM影像專用）。感測器除可同時掃描外亦可進行排序掃描( sequential scanning )。
4.          超靈敏Powewr Hybrid S感測器基本規格：PDE>55% at 450-560nm，>38% at 560-720nm，>15% at 720-850nm，光譜偵測範圍為410 – 850 nm。
5.          超靈敏光子計量感測器Powewr Hybrid X基本規格：PDE>46% at 500nm，光子偵測模式60Mcounts/s，標準模式線訊號反應300Mcounts/s，光譜偵測範圍為410 – 750 nm。
6.          共軛焦分光光譜掃描光路具有單一共軛焦感測孔徑(Pinhole)，微電腦控制，孔徑連續可調。
7.          TauSense偵測技術（TauContrast，TauGating，TauSeperation），將螢光發散時間技術導入光譜式螢光偵測範圍內，可分辨自體螢光之影像，螢光重疊之干擾與完全移除反射光背景光線。
8.          高解析傳統掃描模式之解析最高可達 8192 x 8192，FOV 22 mm，數位化8，12 或16 bits per channel，512 x 512 掃瞄速度10fps，512 x 16 掃瞄速度130fps。
9.          高速掃描模式之解析最高可達 2496 x 2496，FOV 13 mm，數位化8，12 或16 bits per channel，512 x 512 掃瞄速度28 fps，512 x 16 掃瞄速度290fps。
10.      兩組縱深光切掃描裝置(精確度高的Galvanometer Z-stage或行程長的顯微鏡鼻輪z軸控制 )。
11.      可擴充數位光切Digital Light Sheet影像系統
12.      可擴充Superresolution STED系統
13.      可擴充MP DIVE系統
14.      UPS不斷電系統，系統工作桌與防震台。
 
II.專利多重雷射砌合分光系統 ( Acousto Optical Beam Splitter, AOBS ) 
1.          以超音波光學調變裝置篩選激發與釋放波長，激發波長篩選精度達2 nm，無傳統分光濾鏡組。
2.          可同時分光八組雷射激發光源。
3.          可同時程式控制八組雷射激發光源之強度與分光比例。
 
III. 雷射激發系統( 405nm-White Light Laser)與DMOD/AOTF控制系統
1.          脈衝白光雷射系統：440nm-790nm連續可調，調整步徑1nm，波段強度440-485nm > 0.9mW，486-790>1.8mW，78MHz，AOTF控制。
2.          搭配AOBS設計，相當於提供351波段之激發光雷射，且可以同時控制任意8 組可見光激發雷射波段進入，其激發光雷射組合達3 trillion種，完全fully tunable的激發光模組。
3.          高功率50 mW 405nm diode laser。
 
IV.系統影像處理工作站與應用軟體
1.          系統影像工作站(以下為現行規格，出貨時依當時原廠提供工作站系統而定，至少等同或高於於此規格)
High power HP Z6G4 workstation with GPU CUDA interface, This GPU processor is ideal for Lightning SR and FLIM application
- CPU: Intel Xeon Gold 6244 processor (8 cores / 16 threads)
- 96 GByte RAM 
- Nvidia Quadro RTX 5000 16GB GPU (3072 cores) 
- 256 GB SATA SSD
- 6TB SATA Enterprise 
- 2TB M.2 SSD for temporary storage of data 
- Keyboard and mouse, Win 10 Pro 64bit
1.          標準系統軟體部分( System software)：
Continuous Scan, Sequential Scan, Single Image Scan, Image Series Scan
AOTF used to minimize specimen bleaching
Dye based pre-sets to control scans (Instrument Settings)
Scan-Parameters are attached to image for later reconstruction.
Unidirectional & phase corrected Bi-directional Scans
Region of interest scan
Frame Average, Line Average
2.          應用軟體部份( Application software)：
白光雷射應用的專屬掃描模式
電動載物台的multi-position scan與Mapping scan
3D projection and animation
Falcon FLIM application
Lightning confocal superresolution
LAS X Navigator application
 
V.共軛焦專用全自動倒立螢光顯微鏡
1.          自動倒立式螢光顯微鏡，內置共軛焦掃描專用光路控制器，可直接銜接共軛焦掃描器，且螢光模式與共軛焦掃描模式為電動切換，可由共軛焦軟體直接控制。
2.          無線遠光學修正系統設計與光學平衡對比修正設計- Harmonic Contrast System。
3.          採用外掛式電動控制系統，遠離電控裝置可能產生的電磁干擾。
4.          顯微鏡基座內建LED穿透光燈源，目鏡一對10x，FOV=25mm。
5.          6孔電動鏡頭鼻輪，移動行程：12mm。
6.          7孔電動旋轉聚光鏡，工作距離28mm以上。
7.          4孔電動旋轉干涉對比(DIC)用菱鏡轉盤。
8.          電動掃瞄式XY載物台，移動行程：127 mm x 83 mm。
9.          6孔電動旋轉螢光濾鏡組，外接式LED螢光光源，激發範圍390-680nm。
10.      螢光濾鏡組，供DAPI，GPF，RFP，Cy5螢光染劑觀察使用。
11.      850nm LED自動對焦系統，驅動電動鼻輪。
 
VI.共軛焦專用高解析物鏡組
1.          HC PL APO 10x/0.40 CS2, WD=2.74mm共軛焦專用
2.          HC PL APO 20x/0.75 IMM CORR CS2, WD=0.66mm共軛焦專用
3.          HC PL APO 40x/1.25 GLYC CORR, CS2 WD=0.35mm,共軛焦專用
4.          HC PL APO 63x/1.40 OIL, CS2 WD=0.14mm,共軛焦專用
5.          HC PL APO 100x/1.40 OIL, CS2 WD=0.13mm,共軛焦專用
6.          40x以上物鏡DIC配件組。
 
VII.共軛焦顯微鏡超解析(Lightning)系統
1.          側向解析度(dxy@488nm激發)由傳統共軛焦~200nm提升至120nm(@488nm)，縱向解析度(dz)由傳統共軛焦~700nm提升至400nm(@488nm)。
2.          使用現有之共軛焦高感度Power HyD系列偵測器，維持光譜式偵測系統，亦即可同時進行多channel，多色的超解析影像擷取。
3.          可使用於多色活細胞超解析影像。
4.          進行共軛焦顯微鏡超解析掃描時，掃瞄速度與一般共軛焦影像掃描速度相同，不因超解析掃描而減慢速度。
 
VIII. 螢光生命週期影像系統(Falcon FLIM)
1.             使用白光雷射系統，同時觀察共軛焦及單分子量測系統分析。
2.             配合單分子量測系統專用之水冷式超靈敏Hybrid APD/GaAsP螢光感測器之暗電流雜訊可達400 cps 以下。
3.             與共軛焦系統完全整合，無需開啟其他軟體即可進行螢光生命週期分析。
4.             軟體內建自動校正功能，可針對不同雷射及感測器進行校正。
5.             螢光生命週期分析模式包括FLIM、FRET、和Pattern Fit。
6.             螢光相關光譜系統具備多種曲線擬合模式，包括 Pure Diffusion，Diffusion with Triplet，Triplet Extended 3D，Protonation和Conformational。
 
 
   
 
    此四套系統【Leica TCS SP5】、【Leica TCS SP5 II】、【Nikon A1R】及【Leica Stellaris 8】之主要配置如下：
 
Leica TCS SP5
Leica TCS SP5 II
Nikon A1R
Leica Stellaris 8
PMT/HyD
yes/yes
yes/no
yes/no
no/yes
Scanning stage
Yes
Yes
Yes
Yes
Laser system
405nm Diode laser
Argon Blue-458, 476, 488, 496, 514nm
DSPP 561nm
HeNe Red 633nm
405nm Diode laser
Argon Blue-458, 476, 488, 496, 514nm
HeNe 543nm
HeNe Orange 594nm
HeNe Red 633nm
LU-N4:405/488/561/640nm波長雷射組
405nm Diode laser
脈衝白光雷射系統WLL：440nm-790nm
Live cell incubation
Yes
Yes
Yes
Yes
 

 

由於系統配備的差異，若使用者有活細胞培養觀察需求，建議搭配使用HyD接收器(新式接收器，靈敏度較高)，雷射光能量需求較低，較不易使得檢體發生光毒害而螢光衰減的現象。   

 

 

 

   
 
 
五、參考資料

 1、 雷射掃瞄共軛焦顯微鏡的原理與概論

 2、 TCS SP5簡易操作流程

 
公告日:2011/02/21





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